摘要：
相关研究已经证实，香豆素及其衍生物（包括7-羟基-4-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、7-氨基-4-甲基-3-香豆素乙酸、7-乙氧基-4-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素乙酸和7-氨基-4-甲基香豆素）均具有荧光性，而在室温水溶液中，使用4-羟基TEMPO即可使它们发生荧光淬灭。为了解4-羟基TEMPO在香豆素衍生物荧光淬灭中所发挥的作用以及所涉及的机制，本研究分别对所有香豆素衍生物在4-羟基TEMPO作用下的吸收光谱、荧光发射光谱以及荧光衰减曲线进行了分析。从4-羟基TEMPO对不同香豆素衍生物荧光猝灭的Stern-Volmer曲线（来自时间平均和时间分辨测量）可以看出，曲线均没有出现向上弯曲（正偏离）。并且这种荧光淬灭是一种完全动态淬灭，这一点可以进一步得到不同温度下的Stern-Volmer曲线的证实。除此之外，本研究对室温下所有香豆素衍生物Stern-Volmer荧光猝灭常数和双分子猝灭速率常数进行了计算。本研究所得结果证明，未来有可能建立一种能够对自由基（4-羟基TEMPO）清除剂水平进行定量测定的分析方法。
1. 引言
众所周知，香豆素类化合物种类繁多，这种酚类物质在自然界中已经被鉴定出的种类就已超过1300种，并且这类化合物有多见于绿色植物。对于香豆素类化合物而言，其药理和生化特性以及治疗应用会因其上的取代基不同而表现出显著差异。并且相关研究已经证实，这类生物活性化合物不仅具备自由基清除能力，同时还能够在抗癌、抗菌、抗炎、抗增殖、抗菌、抗HIV和抗真菌等方面发挥重要作用。除此之外，人们发现，许多香豆素类化合物还具有抗氧化作用。
通过研究香豆素类化合物荧光猝灭可获得大量涉及香豆素的信息，其中，荧光猝灭是指荧光物质与溶剂或其他溶质分子相互作用,引起荧光强度降低、消 失或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。并且截至目前，人们已经通过稳态和瞬态方法就不同猝灭剂(如苯胺、溴苯、金属离子)对溶液中有机分子的荧光猝灭作用进行了大量研究。并且尽管人们已经发现了很多能够淬灭香豆素类化合物荧光的猝灭剂，但是很少有工作会对这一过程进行表征，因此很少会在生物样品研究中得到实际应用。
4-羟基TEMPO是一种稳定的硝酰自由基，并且其具有生物膜穿透能力，因此可以有效保护细胞和组织免受氧化应激的损伤。本项研究分别利用稳态和时间分辨荧光测量方法对水溶液中4-羟基TEMPO对香豆素衍生物（8种）的荧光猝灭过程进行了分析，以其能够深入理解其中所涉及的机制。
2. 材料和方法
本研究所涉及8种香豆素衍生物（包括7-羟基-4-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、7-氨基-4-甲基-3-香豆素乙酸、7-乙氧基-4-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素乙酸和7-氨基-4-甲基香豆素）和4-羟基TEMPO均购自Sigma公司；所用溶剂均为去离子水；为避免自淬灭的影响，本研究所有香豆素衍生物溶液的浓度均相等(1*10-5M)。除此之外，4-羟基TEMPO原液浓度亦为一个恒定值(0.25M)。
本研究分别使用UV-Vis分光光度计(温度为25°C，扫描速度为266.75 nm·min−1，狭缝为2 nm，数据间隔为1 nm)和荧光分光光度计(温度为25°C，扫描速率为600 nm·min−1，激发和发射狭缝为5 nm，平均时间为0.1s，数据间隔为1 nm)来记录相应香豆素衍生物的吸收光谱和发射光谱。其中，每种香豆素衍生物的“激发波长”均被表示为其“最大吸收波长”。本研究对在没有4-羟基TEMPO和存在不同浓度的4-羟基TEMPO的情况下所有荧光吸收光谱以及荧光发射光谱进行记录。本研究发现，在所有被测温度点（15、25、35、45和55°C）下，在4-羟基TEMPO存在时，所有香豆素衍生物的荧光强度均发生了降低。在该等实验中，在没有4-羟基TEMPO和存在不同浓度的4-羟基TEMPO(50μL，0.05-0.25M)的情况下，本研究对每种香豆素衍生物溶液(1.95mL，1*10^-5M)的荧光强度进行了测定。并且在每次加入4-羟基TEMPO后，轻轻搅拌溶液，并对其荧光强度进行测定。
本研究通过荧光分光光度计对室温下的体系进行了时间分辨荧光测量。在这些实验中，本研究利用单光子计数技术对上述8种香豆素衍生物(2.5mL，1·10−，5M)在无4-羟基TEMPO和存在不同浓度4-羟基TEMPO(20-100μL，0.25M)下的荧光寿命分别进行了测定。在所有实验中，本研究所用激发波长均为340 nm。并且在每次加入4-羟基TEMPO后，轻轻搅拌溶液，并对其荧光寿命进行测定。
本研究随后利用半经验分子轨道程序包MOPAC(AM1方法)对一系列香豆素衍生物的电离势和分子半径分别进行了理论计算。除此之外，本研究利用Avogadro进行了几何优化，然后计算得出相应衍生物的分子半径。最后，本研究使用跨平台计算机程序进行了分子构建、结构可视化以及数据分析过程。
3. 结果和讨论
本研究对在不存在4-羟基-TEMPO以及存在不同浓度的4-羟基-TEMPO时，所有香豆素衍生物在水溶液中的UV吸收光谱和荧光发射光谱分别进行了记录和分析。所得结果显示，在所有8中香豆素衍生物中，其荧光性能在4-羟基TEMPO存在时的变化趋势均相同。作为一个示例，本研究在图1中给出了7-氨基-4-甲基-3-香豆素乙酸的相应荧光光谱。从图中可以看出，(a)各化学荧光团的荧光强度会随4-羟基TEMPO浓度的增加而逐渐降低；(b)吸收光谱和荧光光谱形状和谱带最大值（band maxima）均保持不变；(c)在4-羟基TEMPO存在下，荧光强度并不随时间发生变化；(d)荧光团的其他发射带均没有发生红移。从该部分结果可以看出，该等猝灭过程中并不涉及永久性光化学反应，香豆素类衍生物与4-羟基TEMPO之间相互作用类型完全是一种物理类型。除此之外，从这些结果中还可以看出，4-羟基TEMPO并不会改变荧光团的吸收和光谱性质，因此可以认为，加入4-羟基TEMPO并不会使得香豆素类衍生物形成了发射激基复合物。
为确定上述8种香豆素衍生物在4-羟基TEMPO存在下的荧光猝灭所涉及的机理，本研究使用时间分辨荧光光谱法对相应的Stern-Volmer方程进行了分析（如图2所示）。在不同的波长下，本研究利用不同的波长对各荧光团在存在（和不存在）4-羟基TEMPO的情况下的荧光寿命分别进行了测定，这些波长与相应最大发射波长(7-羟基-4-甲基香豆素：451 nm；5,7-二甲氧基香豆素：453 nm；7-氨基-4-甲基-3-香豆素乙酸：451 nm；7-乙氧基-4-甲基香豆素：388 nm；7-甲氧基香豆素：395 nm；7-羟基香豆素：459 nm；7-羟基-4-甲基香豆素乙酸：461 nm；以及7-氨基-4-甲基香豆素：441 nm）相对应。
本研究结果显示，在所有被测4-羟基TEMPO浓度下，该等香豆素衍生物的荧光猝灭行为均几乎完全符合Stern-Volmer方程所表示的线性关系。没有证据表明存在偏离线性度的情况。这说明，在该等体系下，香豆素衍生物的荧光猝灭并不会有动态猝灭和静态猝灭的同时参与。除此之外，在本研究所涉及的全部香豆素衍生物中，在存在4-羟基TEMPO时，相应的Stern-Volmer曲线斜率均大于0(这说明4-羟基TEMPO的加入确实会对荧光团荧光寿命产生影响)，这说明存4-羟基TEMPO对香豆素衍生物的荧光猝灭作用涉及一种动态猝灭机制。为进一步证实荧光猝灭动力学机制，本研究在稳态测量的基础上建立了温度对Stern-Volmer常数的影响。图3显示了在5个温度(15、25、35、45和55°C)下，水溶液中，4-羟基TEMPO对7-氨基-4-甲基-3-香豆素乙酸的荧光猝灭所对应的Stern-Volmer曲线。
从图3可以看出，相应Stern-Volmer曲线的斜率均会随温度的升高而逐渐增大，这说明，4-羟基TEMPO对香豆素衍生物的荧光猝灭是一种动态猝灭行为。需要指出的是，对于上述8种香豆素衍生物而言，通过稳态测量获得的Kd值约是通过时间分辨测量获得的Kd值的两倍。由于4-羟基TEMPO与上述香豆素衍生物吸收和发射波长相同，因此4-羟基TEMPO在激发和发射波长上均能后起到滤光器的作用。因此，本研究决定存在内滤波效应的荧光发射强度进行校正。再校正后可以看出，线性度偏差均发生了显著减小，F0/F曲线在τ0/τ值的实验误差范围内(数据未显示)。表1收集了通过时间分辨测量所获得的荧光猝灭结果。从表中可以检出，本研究测得荧光寿命与文献数据具有较好的一致性。
为更好地了解上述8种香豆素衍生物的猝灭电离势的机理，本研究用过理论计算方法分别对它们的分子半径和猝灭电离势进行了测定（如表2所示）。
本研究结果显示，对于上述8种香豆素衍生物而言，其双分子猝灭速率常数与相应电离势之间并不存在相关性，因此可以确定，该等荧光淬灭并不涉及电子转移机理。除此之外，本研究发现，香豆素衍生物双分子猝灭速率常数与其分子半径之间亦无相关性。需要指出的是，这种相关性的缺失很可能是因为这些分子尺寸相当，因此无法显示出一些关于“规律性”的信息。除此之外，从表1中可以看出，该等双分子猝灭速率常数与在水中进行研究所获得的扩散速率常数具有相同数量级。因此可以认为，该等双分子过程很可能属于扩散受限过程。因此其相关猝灭机理可通过另外一条路线进行解释（如图4所示）。
4. 结论
本项研究针对4-羟基TEMPO对不同香豆素衍生物的荧光猝灭作用进行了分析。结果表明，上述8种香豆素衍生物的荧光在4-羟基TEMPO的存在下都会发生淬灭。并且在4-羟基TEMPO浓度较高时，4-羟基TEMPO对不同香豆素衍生物荧光猝灭的Stern-Volmer曲线均没有出现向上弯曲（正偏离），这说明这种荧光淬灭是一种完全动态淬灭。除此之外，本研究还进行了稳态和时间分辨测量，以及假设双分子过程为扩散受限过程的理论计算。本研究证实，使用4-羟基TEMPO作为不同自由基的清除剂具有重要的生物学意义。并且在生理条件下对其进行检测和定量测定有助于了解氧化应激机制。本研究证实，使用4-羟基TEMPO作为不同自由基的清除剂具有重要的生物学意义。并且在生理条件下对其进行检测和定量测定有助于了解氧化应激机制。需要指出的是，由于通过4-羟基-TEMPO研究的香豆素衍生物的荧光猝灭没有显着差异，因此并不适用于4-羟基-TEMPO含量的定量测定。
